抑菌液成分检验标准规范-抑菌液的使用

稀释因子d是指第一次进行菌落总数测定时的样品稀释倍数。在菌落总数测定中，为了得到可以计数的合适菌落数量，一般会将样品进行稀释。稀释因子d表示的就是第一次进行稀释时的稀释倍数。通过在不同稀释度的平板上进行菌落计数，并结合稀释因子d，最终可以计算出样品中的菌落数。

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各种抗菌产品的测试标准（部分）-2020-09-11

抗生素微生物检定管碟法在中国典中的应用及操作要点?

录入时间:2010-11-18 10:29:10 来源：青岛海博?

抗生素微生物检定法可分为：（1）稀释法；（2）比浊法；（3）琼脂扩散法（管碟法和打孔法）。各国典通常采用后两种方法测定抗生素的效价。?

管碟法：利用抗生素在摊布特定试验菌的固体培养基内成球面形扩散，形成含一定浓度抗生素球形区，抑制了试验菌的繁殖而呈现出透明的抑菌圈。?

此法系根据抗生素在一定浓度范围内，对数剂量与抑菌圈直径（面积）呈直线关系而设计，通过检测抗生素对微生物的抑制作用，比较标准品与供试品产生抑菌圈的大小，计算出供试品的效价。?

原理：利用抗生素在固体培养基中的平面扩散作用，依据量反应平行线原理并采用交叉实验设计方法，在相同实验条件下通过比较标准品（已知效价）和供试品两者对所接种试验菌产生的抑菌圈（直径或面积）大小，来测定供试品效价的一种方法。 ?

管碟法的操作步骤：?

1、预试验：确定最佳的试验条件：调整试验菌的浓度、使用量、抗生素终浓度、培养基等，使抑菌圈的大小符合规定：一剂量法中心点的抑菌圈直径应在16～17.5mm，二剂量法高剂量浓度标准品溶液所致的抑菌圈直径在18～22mm，三剂量法中间剂量浓度标准品溶液所致的抑菌圈直径在15～18mm。?

2、试验准备：双碟、钢管、毛细滴管、吸管的清洗及灭菌；容量瓶、定量吸管的清洗；培养基、缓冲液的准备、半无菌间的紫外消毒等。?

3、双碟的制备：每只双碟加底层培养基约20ml，待培养基凝固后，将双碟放入35～37℃培养箱中，待用。?

4、供试品、标准品溶液的制备：估计供试品的效价，根据试验要求设计供试品、标准品溶液稀释步骤，平行制备供试品、标准品相关剂量的溶液。?

5、菌层的制备：注意菌层培养基温度；根据预试验确定加入菌层培养基的菌液量，注意制备菌层的速度和平整度。?

6、滴加抗生素溶液：注意标准品、供试品高、低剂量溶液滴加顺序，保证滴加速度和加量的均匀一致。 7、双碟的培养：根据培养温度的要求在培养箱中进行培养，培养箱中水平碟放的双碟数以不超过三层

为宜。?

8、抑菌圈的测量：抑菌圈测量仪的使用，每组试验双碟应在相同的测量参数下进行测量。手工测量：游标卡尺?

9、结果的可靠性检验及效价测定：抑菌圈测量仪提供计算结果或手工计算结果。 ?操作要点?

第一步一般应制成500或1000单位/毫升的溶液，以后逐步稀释至供试浓度的溶液，稀释步骤应为3～4步。?

溶解：对于需用乙醇溶解的样品，由于溶解样品时所用乙醇量较大，加灭菌水后溶液放热，因此需充分摇匀后加灭菌水至接近容量瓶刻度，待冷至室温后再稀释至刻度。?

标准品溶液与供试品溶液浓度的比值D应控制在±5%以内，以保证两者浓度的偏差在一定范围内。 试验菌的菌龄对抑菌圈有一定影响。故检定时应保持菌种及菌液的新鲜。?

一般菌种一月转种一次，冰箱冷藏保存。对易变异的菌株，如藤黄微球菌等在制备菌悬液前进行单菌分离；其他菌株可半年分离一次。?

试验菌传代最好不超过5次，以防止菌种老化变异。芽孢杆菌培养物用灭菌水洗下后，应在65℃加热30分钟，使菌体的菌龄一致，用革兰氏染色，应有芽孢85%以上。?

加入菌悬液的体积，一般不少于0.3ml，并且不大于上层培养基体积的2%。如果加入菌悬液的体积过小，则在同次实验中，不同次加入菌悬液的体积相差较大，造成实验误差；如果加入菌悬液的体积过大，则会使上层培养基变稀，并且因菌悬液的温度较低，加至培养基中可能造成培养基结块，影响测定结果。对于加入菌悬液体积的控制，可通过调节菌悬液的浓度来实现。?

在制备菌层培养基时，将菌液加入菌层培养基后，立即充分摇匀，但应避免产生气泡。?

加入芽孢悬液时，菌层培养基的温度为65℃，对非芽孢悬液时，菌层培养基的温度一般为48～50℃。 放置孵箱培养时排放应不得超过三层，避免因培养温度不均匀而导致各双碟中抑菌圈大小不一。 ?

抗生素原料：不含辅料的物制剂原料，一般其效价以纯度（u/mg或?g/mg）表示。检验时，可参考该品种的品标准纯度限度规定或厂方提供的纯度估计效价，取样试验，如估计效价与实际效价相差较远时，即测定所得效价超出估计效价的±10%时，则重新估计效价，再做准确测定。?

粉针剂：指用无菌粉末或冻干品，用西林瓶橡胶塞铝盖封装或熔封在安瓶内，一般测定其纯度（u/mg或?g/mg）或整瓶效价。?

取装量差异项下的内容物，称取适量（50mg以上，根据标示量及平均装量折算估计效价，并按估计效价及量瓶体积计算取样量），置量瓶中，加标准中规定的溶剂溶解，稀释，测定，计算出1mg的效价单位数，再根据平均装量及标示量计算平均每瓶的百分含量。?

水针剂（液）：即抗生素的灭菌水溶液，标示量一般按每毫升含效价单位计。?

效价测定时，量取平均装量项下的内容物或5～10支的内容物，混匀，用干燥的刻度吸管吸取一定量的供试品，将吸管外壁用滤纸拭净，再弃去多余的溶液，使供试品至吸管刻度，沿量瓶颈部内壁缓缓流入已盛有一定量溶剂（以免抗生素结晶析出）的量瓶内，混匀，继续加溶剂至刻度，摇匀，再量取适量稀释至规定的浓度。?

素片、薄膜衣片：称取20片的总量，求出平均片重，研细混匀后，精密称取适量（约相当于1片的重量或根据标示量按平均片重及所用量瓶体积折算取样量），置量瓶中，用标准中规定的溶剂溶解，并稀释至刻度，摇匀。再量取适量稀释至规定浓度。?

注意点：研磨时应注意环境干燥，可在干燥操作柜内操作，研磨要迅速，避免吸湿，因片剂内含辅料较多，辅料可能漂浮于溶液表面，稀释时量取供试溶液应读取辅料下层的溶液切面；如沉淀较多，须待其下沉后再量取上层液；有些辅料吸附抗生素，应加以注意。为节约供试品，可与重量差异检查结合进行。 糖衣片、肠溶片：取标准中规定的片数，置于乳钵中，研细，分次加入规定的溶剂，研磨使其溶解，将研磨液转移至瓶口放有小漏斗的量瓶中，量瓶体积根据供试品标示量、所取片数及抗生素储备液浓度（一般为1000单位/ml）选定，用规定溶剂稀释至刻度，摇匀，静置，使辅料下沉而抗生素已溶解在溶液内，精密吸取量瓶中的上层液适量，作进一步稀释。个别品种标准如同时收载了糖衣片和薄膜衣片，可能规定薄膜衣片也取整片制备供试溶液。?

胶囊剂：取装量差异项下的内容物，混合均匀，研细，根据平均装量，精密称取约相当于1粒胶囊的量或按标示量、量瓶体积及抗生素储备液浓度等计算的取样量，置于量瓶中，加规定的溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，如供试品含有较多的辅料，则照片剂项下的方法进行。?

颗粒剂、干混悬剂：取装量差异项下的内容物，混匀，根据平均装量，精密称取约相当于1袋（包）的量或按标示量、量瓶体积及抗生素储备液浓度等计算的取样量，置于量瓶中，加规定的溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀。量取适量稀释制成供试品溶液。测得效价后，再根据装量差异项下的平均装量，计算出平

均每袋（包）的效价，根据标示量即可算出含量。?

软膏剂、眼膏剂：擦净软膏剂或眼膏剂软管的外壁，切开封口，置于干燥器内约1小时，取干燥的洁净分液漏斗，带手套操作，将膏剂软管连同内容物在天平上称重，取出，将内容物挤入分液漏斗，量约2g，再称取膏剂软管的重量，按减重法以前后称量之差计算分液漏斗内膏剂供试品的量，以不含过氧化物的或石油醚等作溶剂溶解基质，但基质中的抗生素则应不溶于或几乎不溶于该有机溶剂中，以避免提取过程中抗生素的损失。按标准中的规定加提取溶剂至分液漏斗中，振摇，使基质溶解，用规定的缓冲溶液提取抗生素至水相中，用缓冲溶液提取3次，合并3次的提取液，置量瓶中，加缓冲溶液至刻度，依法操作，计算效价。 ?实验要点?

磷霉素钠，磷霉素钙，磷霉素氨丁三醇 主要问题：抑菌圈偏小 解决：?

pH9.0抗Ⅱ号培养基（pH7.8～8.0）?

2. 滴加液后，室温放置1小时后，放入孵箱内培养。?

3. 培养时间以24小时为宜，培养时间短，抑菌圈清晰度不好，培养24h后如抑菌圈仍不清晰，应室温放置一段时间待清晰后再测量。 ?

啤酒酵母菌的培养 主要问题：生长不良?

CP2005：抗Ⅴ号琼脂斜面及抗Ⅳ琼脂斜面?

解决：1. 采用沙氏或YPD酵母菌培养基；2. 32～35℃培养24小时 ?

沙氏培养基 蛋白胨10g 葡萄糖40g 琼脂13g 水1000ml 调节灭菌后pH5.4～5.8?

YPD培养基 蛋白胨10g 葡萄糖40g 酵母粉5g 琼脂13g 水1000ml ?

管碟法特点：?

优点：基本操作和设计适用于各种抗生素，试验结果较稳定；样品用量少，灵敏度高；适合于大批样品的测定。 ?

缺点:凡具有抗菌活性的物质都会干扰测定结果；试验过程长，需第二天才有结果；操作手工化，需熟练人员才能得到较正确的结果；受扩散因素的影响，如培养基原材料的质量，一般琼脂中的杂质可能影响扩散速度及效价强度?

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求助“平板计数法”的标准步骤

各种抗菌产品的测试标准（部分）

抑菌塑料标准

ISO 846-1997塑料--微生物作用的评价

ISO22196:2007塑料制品表面抑菌性能评价方法

JIS Z 2911-1992抗霉性试验方法

JIS Z 2801-2000抑菌塑料抑菌性能试验方法及抑菌效果

ASTM G21-96（2002）合成聚合材料防霉（耐真菌）性能测试标准

ASTM D4576-2008蓝色原材料(真皮)抗霉菌生长的试验方法

ASTM E2149-2013在动态接触条件下测定稳态抑菌剂的抑菌行为

GBT 24128-2009塑料防霉性能试验方法

GB/T 31402-2015塑料 塑料表面抑菌性能试验方法

QB/T 2591-2003抑菌塑料——抑菌性能试验方法和抑菌效果

QB/T 4341-2012抑菌聚氨酯合成革 抑菌性能试验方法和抑菌效果

抑菌金属标准

GB/T 24170.1-2009表面抑菌不锈钢 第1部分：电化学法

YB/T 4171-2008含铜抑菌不锈钢

SN/T 2399-2010抑菌金属材料评价方法

抑菌陶瓷标准

JC/T 897-2014抑菌陶瓷制品抑菌性能

GB/T 28116-2011抑菌骨质瓷器

抑菌玻璃标准

JC/T 1054-2007镀膜抑菌玻璃

抑菌家电标准

NSF P172-2006家用和商用洗衣机除菌性能

GB 21551.1-2008家用和类似用途电器的抑菌、除菌、净化功能通则

GB 21551.2-2010家用和类似用途电器的抑菌、除菌、净化功能 抑菌材料的非常要求

GB 21551.3-2010家用和类似用途电器的抑菌、除菌、净化功能 空气净化器的非常要求

GB 21551.4-2010家用和类似用途电器的抑菌、除菌、净化功能 电冰箱的非常要求

GB 21551.5-2010家用和类似用途电器的抑菌、除菌、净化功能 洗衣机的非常要求

GB 21551.6-2010家用和类似用途电器的抑菌、除菌、净化功能 空调器的非常要求

CAS 157-2007家用杀菌电冰箱

抑菌布料标准

ISO 11721-1-2001 面料 品 纤维素布料品抑菌性的测定 土埋试验 第1部分:防腐处理的评定

ISO 11721-2-2003面料品.纤维素布料品抑菌性的测定.土埋试验.第2部分:防腐处理长期有效性的鉴定

ISO 20645-2004布料织品--抑菌活性度的测定-琼脂扩散盘试验

EN 14119-2003面料品的试验　细菌影响的评估

BS EN ISO 20645-2004面料 织物 .抑菌活性的测定.琼脂扩散木片试验

DIN EN ISO 20645-2005面料织物.抑菌活性的测定.琼脂扩散木片试验

NF G39-014-2005面料织物.抑菌活性的测定.琼脂扩散木片试验

AATCC 100-2004布料材料抑菌后整理剂的评定

AATCC 147-2004织物材料抑菌活性测定:平行条纹法

AATCC 30—2004面料材料抗真菌性的评定:面料材料的防霉防腐性

ISO 20743:2007抑菌后整理布料品的抑菌性能测定

ISO 13629-2:2014面料品抗真菌性能测试标准 第2部分 平板法

ISO 18184:2014抗病毒面料品测试标准

JIS L 1902-2002面料制品抑菌活性和效率的测试

GB/T 20944.1-2007面料品 抑菌性能的评价 第1部分:琼脂平皿扩散法

GB/T 20944.2-2007布料品 抑菌性能的评价 第2部分:汲取法

GB/T 20944.3-2008面料品 抑菌性能的评价 第3部分:震荡法

GBT 24346-2009面料品 防霉性能的评价

GBT 24253-2009面料品 防螨性能的评价

FZ/T73023-2006抑菌针织物品

SN/T 2162-2008壳聚糖抑菌棉花 纺织 织品检验规程

FZ/T 62015-2009抑菌毛巾

FZT 62012-2009防螨床上用品

FZT 60030-2009家用面料品防霉性能测试方法

FZ/T 54034-2010抑菌聚酰胺预取向丝

FZ/T 54035-2010抑菌聚酰胺弹力丝

DB35/T 1058-2010抑菌涤纶长丝

SN/T 2558.4-2012进出口 功能性面料 品检验方法 第4部分：抑菌性能 平板琼脂法

FZ/T 52035-2014抑菌涤纶短纤维

抑菌鞋类产品标准

ISO16187:2013鞋类和鞋类部件抗细菌性能评估试验方法

DB35/T 1048-2010抑菌鞋用针织物间隔织物

QB/T 2881－2013鞋类和鞋类部件 抑菌性能技术条件

HG/T 3663-2014胶鞋抑菌性能的试验方法

抑菌涂料标准

GB/T 21866-2008抑菌涂料（漆膜）抑菌性测定法和抑菌效果

GB/T 1741-2007漆膜耐霉菌性测定法

HG/T 3950-2007抑菌涂料

抑菌板材标准

LYT 1926-2010抑菌木（竹）质地板 抑菌性能检验方法和抑菌效果

JC/T 2039-2010抑菌防霉木质装饰板

LYT 2230-2013人造板防霉性能评价

抑菌建筑材料标准

JC/T 885-2001建筑用防霉密封胶

JC/T 939-2004建筑用抑菌塑料管抗细菌性能

抑菌家具标准

QB/T4371-2012家具抑菌性能的评价

抑菌日化标准

QB/T 2850-2007抑菌抑菌型清洗剂

QB/T 2738-2005日化产品抑菌抑菌效果的评价方法

DB35/T 977-2010抑菌型纸尿裤（含纸尿片/垫）

抑菌橡胶真皮标准

JIS T9107-2005单用途抑菌外科橡胶手套

QB/T 4199-2011真皮 防霉性能测试方法

HG/T 4301-2012橡胶防霉性能测试方法

抑菌仪器标准

SC 123-1984渔船电子设备防盐雾、防霉、防湿热的技术要求

CH/T 8002-1991测绘仪器防霉、防雾、防锈

JB/T 5750-2014气象仪器防盐雾、防潮湿、防霉菌 工艺技术要求

含量测定标准

GB/T 28023-2011絮用纤维制品抑菌后整理剂残留量的测定

SN/T 2936-2011进出口水性涂料中酚类防霉剂的测定 高效液相色离谱法

SN/T 3124-2012橡胶及橡胶制品中酚类防霉剂的测定 高效液相色谱法

SN/T3655-2013吃品接触材料 纸、再生纤维材料 异噻唑啉酮类抑菌剂的测定 液相色谱-质谱/质谱法

其他抑菌标准

DA/T 26-2000挥发性档案防霉剂防霉效果测定法

GBT 23164-2008地毯抗微生物活性测定

GB/T 4768-2008防霉包装

卫生标准

GB 15981-1995消毒和灭菌效果的评价方法和标准 附录B：消毒剂定性消毒试验； 附录C：消毒剂定量消毒试验

GB 15979-2002一次性使用卫生用品卫生标准 附录C4：溶出性抗(抑)菌产品 附录C5：非溶出性抗(抑)菌产品

GB19192-2003隐形眼镜护理液卫生要求

GB/T15979-2002

1．操作方法：以无菌操作取检样25g（或25ml)，放于225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内（瓶内预置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨制成1：10的均匀稀释液。固体检样在加入稀释液后，最好置灭菌均质器中以8000~10000r/min的速度处理1min，制成1：10的均匀稀释液。用1ml灭菌吸管吸取1：10稀释液1ml，沿管壁徐徐注入含有9ml灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内，振摇试管混合均匀，制成1：100的稀释液。另取1ml灭菌吸管，按上项操作顺序，制10倍递增稀释液，如此每递增稀释一次即换用1支1ml灭菌吸管。2．无菌操作：操作中必须有“无菌操作”的概念，所用玻璃器皿必须是完全灭菌的，不得残留有细菌或抑菌物质。所用剪刀、镊子等器具也必须进行消毒处理。样品如果有包装，应用75%乙醇在包装开口处擦拭后取样。操作应当在超净工作台或经过消毒处理的无菌室进行。琼脂平板在工作台暴露15分钟，每个平板不得超过15个菌落。3．采样的代表性：如系固体样品，取样时不应集中一点，宜多采几个部位。固体样品必须经过均质或研磨，液体样品须经过振摇，以获得均匀稀释液。4．样品稀释误差：为减少样品稀释误差，在连续递次稀释时，每一稀释液应充分振摇，使其均匀，同时每一稀释度应更换一支吸管。在进行连续稀释时，应将吸管内液体沿管壁流入，勿使吸管尖端伸入稀释液内，以免吸管外部粘附的检液溶于其内。为减少稀释误差，SN标准采用取10mL稀释液，注入90mL缓冲液中。5．稀释液：样品稀释液主要是灭菌生理盐水，有的采用磷酸盐缓冲液（或0.1%蛋白胨水），后者对食品中已受损伤的细菌细胞有一定的保护作用。如对含盐量较高的食品（如酱油）进行稀释，可以采用灭菌蒸馏水。1．操作方法：根据标准要求或对污染情况的估计，选择2~3个适宜稀释度，分别在制10倍递增稀释的同时，以吸取该稀释度的吸管移取1ml稀释液于灭菌平皿中，每个稀释度做两个平皿。将凉至46℃营养琼脂培养基注入平皿约15ml，并转动平皿，混合均匀。同时将营养琼脂培养基倾入加有1ml稀释液（不含样品）的灭菌平皿内作空白对照。待琼脂凝固后，翻转平板，置36±1℃温箱内培养48±2h，取出计算平板内菌落数目，乘以稀释倍数，即得每克（每毫升）样品所含菌落总数。2．倾注用培养基应在46℃水浴内保温，温度过高会影响细菌生长，过低琼脂易于凝因而不能与菌液充分混匀。如无水浴，应以皮肤感受较热而不烫为宜。倾注培养基的量规定不一，从12~20ml不等，一般以15ml较为适宜，平板过厚可影响观察，太薄又易于干裂。倾注时，培基底部如有沉淀物，应将底部弃去，以免与菌落混淆而影响计数观察。3．为使菌落能在平板上均匀分布，检液加入平皿后，应尽快倾注培养基并旋转混匀，可正反两个方向旋转，检样从开始稀释到倾注最后一个平皿所用时间不宜超过20min，以防止细菌有所亡或繁殖。。4．培养温度一般为37℃（水产品的培养温度，由于其生活环境水温较低，故多采用30℃）。培养时间一般为48h，有些方法只要求24h的培养即可计数。培养箱应保持一定的湿度，琼脂平板培养48h后，培养基失重不应超过15%。5．为了避免食品中的微小颗粒或培基中的杂质与细菌菌落发生混淆，不易分辨，可同时作一稀释液与琼脂培基混合的平板，不经培养，而于4℃环境中放置，以便计数时作对照观察。在某些场合，为了防止食品颗粒与菌落混淆不清，可在营养琼脂中加入氯化三苯四氮唑（TTC），培养后菌落呈红色，易于分别。1．操作方法：培养到时间后，计数每个平板上的菌落数。可用肉眼观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏。在记下各平板的菌落总数后，求出同稀释度的各平板平均菌落数，计算处原始样品中每克（或每ml）中的菌落数，进行报告。2．到达规定培养时间，应立即计数。如果不能立即计数，应将平板放置于0－4℃，但不得超过24h。3．计数时应选取菌落数在30~300之间的平板（SN标准要求为25~250个菌落），若有二个稀释度均在30~300之间时，按国家标准方法要求应以二者比值决定，比值小于或等于2取平均数，比值大于2则其较小数字（有的规定不考虑其比值大小，均以平均数报告）。4．若所有稀释度均不在计数区间。如均大于300，则取最高稀释度的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。如均小于30，则以最低稀释度的平均菌落数乘稀释倍数报告之。如菌落数有的大于300，有的又小于30，但均不在30~300之间，则应以最接近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。如所有稀释度均无菌落生长，则应按小于1乘以最低稀释倍数报告之。有的规定对上述几种情况计算出的菌落数按估算值报告。5．不同稀释度的菌落数应与稀释倍数成反比（同一稀释度的二个平板的菌落数应基本接近），即稀释倍数愈高菌落数愈少，稀释倍数愈低菌落数愈多。如出现逆反现象，则应视为检验中的差错（有的食品有时可能出现逆反现象，如酸性饮料等），不应作为检样计数报告的依据。6．当平板上有链状菌落生长时，如呈链状生长的菌落之间无任何明显界限，则应作为一个菌落计，如存在有几条不同来源的链，则每条链均应按一个菌落计算，不要把链上生长的每一个菌落分开计数。如有片状菌落生长，该平板一般不宜采用，如片状菌落不到平板一半，而另一半又分布均匀，则可以半个平板的菌落数乘2代表全平板的菌落数。7．当计数平板内的菌落数过多（即所有稀释度均大于300时），但分布很均匀，可取平板的一半或1/4计数。再乘以相应稀释倍数作为该平板的菌落数。8．菌落数的报告，按国家标准方法规定菌落数在1~100时，按实有数字报告，如大于100时，则报告前面两位有效数字，第三位数按四舍五入计算。固体检样以克（g)为单位报告，液体检样以毫升（ml）为单位报告，表面涂擦则以平方厘米（cm）报告。

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GB 15981-1995

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12.2